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地中海型貧血之遺傳學
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轉載於成大遺傳諮詢中心
成大醫院婦產部 優生保健科 郭保麟醫師  


在人類所有的遺傳疾病當中,地中海型貧血(thalassemia)可能是分佈最普遍,同時也是被研究得最透徹的疾病。以下分成四部份來介紹地中海型貧血。

一、單基因疾病與分子遺傳學

自從Watson 和Crick 在1953 年發現去氧核糖核酸的雙股鏈構造以來,分子生物學的進步如一日千里。現在分子生物學(或遺傳工程)的技術,已經可以定出不同基因在各個染色體上面的位置,並且將染色體上的基因加以解碼,而找出每個基因之內核@酸(neucleic acid)的排列次序。

據估計人類每個細胞之內,大約有3×109 核酸,大都是分佈在46 個染色體上面。衹有少數的核酸,是位於細胞質的細腺體(mitochondria)上面。人類的遺傳疾病可以分成幾個大類:一是單基因疾病,就是個別基因有缺陷,而且會遺傳給下一代的疾病。二是染色體異常,包括染色體數目上和結構上的異常。三是先天性異常和許多與遺傳有關係的常見疾病,例如高血壓,高血脂。一般認為這些疾病的表現涉及多個基因和環境因素之間的互動。四是粒腺體基因的病變。五是體細胞突變,例如癌症。目前已知癌症起因於後天的,多發性的體細胞突變。以下所要討論的地中海型貧血即是標準的單基因疾病。

單基因疾病總共有多少?

根據Mckusick 教授的統計,有2208種業經證實,另外2136 種可能是單基因缺陷引起的表現型,總共是4344(1988 年)。在2208 種確定的單基因疾病中,1433 種是自體顯性遺傳,626 種是自體隱性遺傳,139 種是性連遺傳。然而,相同的遺傳疾病在不同種族之間,其發生率及基因型(genotype)和表現型(phenotype)也不盡相同。

二、地中海型貧血的分子遺傳學及遺傳學及臨床表現


血紅素是由四條胜月太(peptide chain)所組成的分子,負責氧氣的輸送。其中兩條多胜月太鏈屬於α鏈,另外兩條屬於β類。α類胜月太鏈包括α鏈和ζ鏈,它們的基因位於第十六號染色體的短臂上,一般正常人有一個ζ基因和兩個α基因(α1α2)在同一個染色體上面,所以一共有兩個ζ和四個α基因。β胜月太鏈包含ε、γ、δ、β,它們的基因位於第十一號色體的短臂,一般正常人有二個ε、γ、δ和β基因。在胚胎早期,ζ基因及ε基因即表現出來,然後逐漸由α鏈及γ鏈所取代。

故在胎兒時期最主要的血紅素為α2γ2。出生之後,γ鏈的合成逐漸減少,由β鏈取代,到了六個月大之後,體內血紅素主要成份為α2β2(HbA),另外有少量的α2δ2(HbA2)。地中海型貧血(thalassemia)有許多種,最主要的還是α及β地中海型貧血。所謂α地中海型貧血為α胜月太鏈的合成減少或異常。

照嚴重程度來分,可以分成(1)單基因缺損。(2)二基因缺損。(3)三基因缺損。(4)四基因缺損。

基因臨床表現如下:單因缺損在臨床上沒有什麼症狀,血液學檢查也無法與正常人區分,衹能用分子生物學的方法鑑定出來。二基因缺損的病例,即是一般所指的α地中海型貧血帶因者,在臨床上也通常沒有症狀,惟一的表現是紅血球體積(MCV:mean corpuscular vol-ume)過小。三基因缺損的病例即血紅素H症。

由於β胜月太鏈的合成因α鏈之減少而相對增多,許多β鏈結合成β4(HbH)。這類病人一般有相當明顯的貧血,有時候因為脾臟腫大需要作脾臟切除術。四基因缺乏的病例,在胎兒時期便會出現全身性水腫,這是因為完全沒有α鏈的製造,長期缺氧,心臟衰竭,造成胎兒水腫(hydrops fetalis)。由於完全沒有α胜月太鏈,造成γ胜月太鏈過剩,形成許多γ4(Hb Bart’s),因此又稱為Hb Bart’s hydrops fetalis。α地中海型貧血,絕大多數是因為基因的缺失(deletion)所造成。而在不同的種族之間,造成α地中海型貧血的基因缺失形態也有所不同。β地中海型貧血則是因為β胜月太鏈合成減少或異常,由於人類體內有兩個β基因,單基因缺損的病例即帶因者,如果兩個基因缺損,即是重度β地中海型貧血(β- thalassemia major)。

β地中海型貧血帶因者的臨床表現與α地中海型貧血的二基因缺失型類似,遺傳形態也相同。每兩個地中海型貧血的帶因者結合,每次懷孕有1/4 機會產下重度的地中海型貧血。與重度α地中海型貧血不同的是,由於在胚胎時間沒有β胜月太鏈的合成,出生之後三到六個月,當大部分的γ鏈由β鏈取代時,才會開始出現貧血。治療方法,衹有骨髓移植或長期輸血。β地中海型貧血也是隱性遺傳,但與α型不同的是它的基因缺陷絕大多數的核酸的點突變所引起的。在不同的種族裡,常見的點突變形態也不同,但是幾種特定的突酸一般會構成該族群主要的基因缺陷,亦即有種族特異性,此點與α地中海型貧血以及其他種單基因疾病相同。在中國人裡面,至少有17 種以上的β血紅素基因突變型曾經被報告過,而其中有4 種突變最常發生,占所有突變發生機率的90% 以上。另外有一個特殊的現象是β基因不同位置的突變將造成不同程度的臨床表現。所以β地中海型貧血的表現變化多端,從比較輕度的β+地中海型貧血到需完全依賴輸血的βo地中海型貧血都有。

三、地中海型貧血的流行病學與篩檢


地中海型貧血是全世界分佈最廣泛,發生率最高的遺傳疾病。它的發生率以泰國、義大利、希臘、賽普路斯、薩丁尼亞等地為最高。在這些地區,帶因率據估計以百分之七到二十,而每一百個小孩當中,就可能有一個是重度的地中海型貧血患者。在台灣及大陸東南各省,β地中海型貧血的帶因率是1%~3%,而α地中海型貧血為2%~15%。成大醫院所得結果顯示α地中海型貧血的帶因率接近5%,而β型的帶因率在1%到2%之間。由於台灣是地中海型貧血的盛行地區,婚前或孕前的篩檢極為重要。

以靜脈血即可很容易找出絕大多數臨床上有意義的帶因者。α及β型的帶因者其平均血球容積均小於80,然而在β型的帶因者,其HbA2>4,另外有部份病例HbF 會升高。如果夫妻同為α或β地中海型貧血的帶因者,則每次懷孕有1/4的機會生下異常的小孩,而婚前或孕前的管檢,可以找出帶因者,將來懷孕早期,可以作產前診斷,以避免悲劇的發生,而達到優生保健的目的。

四、地中海型貧血的產前診斷


產前診斷地中海型貧血有兩種方法,一種是在懷孕早期(16 週之前),使用絨毛膜切片或羊膜穿術,拿羊水細胞或絨毛細胞,作分子生物學診斷,另外可以在妊娠17 週之後,在超音波導引之下,作胎兒臍帶血穿刺術,以臍血作電泳或高效能液相層析,可以分析α、β、γ三種胜月太鏈合成的比例。如果臍血中,大部份是Hb bart’s 或γ鏈,則為重度α地中海型貧血。如果β鏈合成太低,則為重度β地中海型貧血。由於分子生物學的進步,我們可以在妊娠早期,就精確定出夫妻及胚胎的基因型,故需作臍帶血鑑定的病例,為數極少。及早診斷可以減少病人的痛苦,但是先決條件,仍需要婚前或孕前的篩檢,以找出沒有症狀的帶因者。所以產前檢查項目,應包含血紅素及血球容積,以期在早期妊娠,找出帶因者,並作必要的處置。

結語:由於科技的進步,使得我們對於單因疾病的原因,有更進一步的了解。我目前已經在提供地中海型貧血的產前診斷,希望能夠減少家庭悲劇的發生。

地中海貧血篩檢及診斷所常常遇到的一些問題

成大醫學中心從八十一年開放地中海貧血的基因診斷服務, 到現在為止, 已經累積一千例以上的經驗。個人從事地中海貧血的診斷, 受限於客觀環境, 雖然時斷時續, 但是幾年下來, 多少累積了一些心得, 在此與同仁及同學共同分享。

一、地中海型貧血的分子病理學


α -thalassemia 是因為α -globin 基因缺損所造成,α -globin 基因位在第十六號染色體短臂的末端,每個染色體上有兩個α -globin 基因,每個正常人身上應有四個α-globin 基因。

α -globin 單一基因突變稱為α-thalassemia-2, 在同一個染色體上的兩個α -globin 基因同時缺損稱為α
-thalassemia-1。如果有三個基因同時缺損,稱為HbH 病,這是因為缺乏α-globin,多餘的β -globin 結合成不穩定的tetramer(β 4),也就是HbH。如果有四個基因同時缺損, 就是α -thalassemia major, 在胎兒末期或新生兒期就會死亡。造成α -thalassemia 基因缺損的主要原因是基因缺失(deletion), 在α -thalassemia-2, 便至少有五種基因缺失型, 分別是-α 3.7,-α 4.2, -α 2.7, -α 5.3, -α 3.5, 另外也有非缺失型突變, 例如HbCS, Hb 廣西。造成二基因缺損的原因,有可能是α -thalassemia-1 突變(α α /––),也有可能是同合子型的(homozygous)α -thalassemia-2 突變(α –/α –)。在臺灣,因為主要的突變型為α α /––,如果夫妻同為帶因者,就有可能會生下α -thalassemia major 的小孩(––/––)。至於HbH 病, 基因型有可能是––/α csα 或是––/α –。
與α -thalassemia 相反, β -thalassemia 是因為β -globin 基因缺損所造成。β -globin 基因位在11 號染色體的短臂上, 每個染色體上祇有一個β -globin 基因, 所以每個正常人的細胞之內, 有兩個β -globin 基因。造
成β -globin 基因缺損的主要原因是點突變,如果只有一個β -globin 缺損,便是帶因者, 其臨床表現與α α /––或α –/α –類似。如果兩個β -globin 基因都發生缺損, 便是β -thalassemia major。但是與α -thalassemia major 不同的是β -globin 基因在胚胎及胎兒時期並沒有顯著的表現, 所以β-thalassemia major 患者在新生兒時期是正常的,要出生3~6 個月才會表現出來貧血的症狀。

二、地中海型貧血在臺灣的分子流行病學


臺灣α -thalassemia-2 的發生率大約是1~3%, α -thalassemia-1 的發生率大約是5%。在α -thalassemia-2 的突變之中, 最常見的還是-α 4.2, 3.5 及HbCS。α -thalassemia-1 之中, 最主要的突變型在漢人百分之九十五以上都是東南亞型突變––SEA,這是一段17kb,涵蓋α 1, α 2 基因的突變。在原住民之中,有些帶有菲律賓型––PHIL,或泰國型––THAI 突變,這兩種突變基因缺失的範圍比––SEA 更廣,除了α 1, α 2 基因之外,也涵蓋δ 基因, 這是胚胎時期負責製造α -類血紅素的基因。在HbH 病之中,大約一半基因型是––/α –,另外一半是α α /α Tα,而造成α T 的突變型,絕大部分是HbCS。在α -thalassemia major,絕大部分仍是––SEA/––SEA,祇有少數夾雜菲律賓或泰國型突變。(圖一)



β -thalassemia 的帶因率為1~2%,幾乎都是點突變造成的。在中國人曾經被報告過的就有十七種突變型, 但是其中四種突變型占了絕大多數(>90%): - 28(A→ G), codon 17(AAG→ TAG), codon 41/42(- TCTT), IVS-2 nt 654(C→ T)。其他較少見的突變型是- 32(C→ A), - 30(T→ A), - 29(A→ G), -AAAC(+ 40 to + 43 from cap), initial codon (ATG→AGG), codon 14/15 (+ G), codon 27/28 (+ C), IVS-1 nt 1 (G→ T), IVS-1 nt S(G→ C), IVS-1 3' end (TAG→ GAG), codon 43 (GAG→ TAG), codon 71(+ T), codon71/72 (+ A)。其中- 32, - 30, - 29, - 28 等突變在promoter, 影響到基因的表現,其他大部分的突變發生在exon,但也有部分突變發生在intron,例如IVS-1 nt1, IVS-1 nt5, IVS-1 3' end, IVS-2 nt 654 (IVS 為intervening sequence, 即intron), 影響mRNA 的splicing。

三、地中海型貧血的篩檢

由於臺灣的帶回率相當高, 以CBC 篩檢α -及β -thalassemia 的帶因者已經成為產前例行檢查的一部份, 在α -及β -thalassemia 的帶因者, 其MCV 或MCH 會有降低的情形(MCV< 80 或MCH< 25),但是β -thalassemia 帶因者, HbA2 或HbF 會昇高(HbA2>4.0 或HbF>2.0), 如此可以和α-thalassemia 帶因者區分開來,如果夫妻兩人都屬於同型的帶因者,那麼胎兒就有可能是重型地中海型貧血患者, 需要接受產前診斷。儘管篩檢過程看來相當容易, 但是仍然有一些困難存在, 往往還是必須分析基因型才能確定。

1. 缺鐵性貧血患者的MCV, MCH 都會降低,因此往往不易與地中海型貧血區分。 另外地中海型貧血帶因者也往往同時合併有缺鐵性貧血。

2. 以上傳統的血紅素電泳定量HbA2 及HbF 值,可能不夠精確。特別是如果HbA2 介於3~4 之間, 在α -及β -thalassemia 帶回者的區分上便有所困難。另外HbE 及一些Hb variants 往往與HbA2 或其他成份不易區分。

3. 在HbA2 或HbF 昇高的病例, 除了是β -thalassemia 帶因者之外, 理論上有5%的 機會, 同時也是α-thalassemia 的帶因者, 必須分析基因型。

4. 同時合併α -thalassemia 及β -thalassemia 的病例,MCV 及MCH 可能會正常。

5. 如果實驗室品管不佳,CBC 檢查也會出現偽陰性的情況。圖三是目前我們篩檢的流程,可以使用HPLC 來取代血紅素電泳,可以使篩檢工作更加精確。



四、地中海型貧血的基因診斷


α -thalassemia 主要是基因缺失所引起, 可以使用Southern blot 或PCR 診斷。以PCR 診斷基因缺失有兩個原則,一是放大缺失的基因,如果該基因沒有被放大出來, 表示該基因有homozygous deletion。另外一個原則是放大deletion junction 的DNA 序列,這樣就可以診斷該特定的基因缺失型。目前我們是兩個方法都用,以便作double check-up。至於以Southern blot 診斷, 我們目前有的探針, 可以診斷所有缺失型的α -thalassemia-2及東南亞型α -thalassemia-1 突變。β -thalassemia 由於是點突變, 而且大部份突變有區域特性, 有很多種方法可以用來確定診斷。我們過去嘗試過的方法包括ASO(Allele-Specific Oligonucleotide), ARMS(Amplification Refractory Mutation System), 及PCR 產物的直接sequencing。目前則採取ACRS(Amplification Created Restriction Sites), 至少可以診斷常見的十餘種突變, 如果還無法解決, 再作sequencing。

五、產前基因診斷的一些問題


在作α -thalassemia 的產前診斷時, 很多人常會有的疑問是有無必要例性性作診斷HbH 病的診斷。我們目前的策略是並不考慮,以免引起患者的混亂。因為HbH 病絕大多數都可以活得不錯,最多是偶爾要輸血。而事實上我們又無法從genotype 來完全預測患者的phenotype,在此情況之下,診斷胎兒的genotype 可能反而造成困擾。文獻上確實也有極少數(個位數)的病例因為HbH 病造成胎兒水腫(α -thalassemia major 的表現),但這些極少數病例其基因型都是罕見的非缺失型突變,並無法以例行性的方式診斷出來。即使這些情況發生也不致於引起太多的問題, 因為新生兒在初生之後就無法存活。

β -thalassemia 的診斷比較困難的是所謂的β -thalassemia intermedia,這些患者臨床上的嚴重程度比β-thalassemia major 輕,大約與部分HbH 病接近。造成β -thalassemia intermedia 的原因可能有二: 一是兩個β -globin 基因都發生突變, 但是一個突變造成β -globin 完全沒有功能, 另一個突變造成基因還保留有部分的功能(β 0/β - )。二是祇有單基因突變, 但是因為同時合併其他血液上的病變, 例如HbH 病(––/α –), 造成比較嚴重的臨床表現。到目前為止, 有關中國人的β -thalassemia intermedia 還沒有很好的研究。β-thalassemia intermedia 與HbH 病類似,都可能造成診斷上的盲點, 所幸這些病例相當少見。

六、實驗室品管


我們目前實驗室的品管控制得相當嚴格, 胎兒檢體除了一定與父母親檢體同時分析之外,每個檢體至少分析三次(未培養檢體二次,經培養檢體一次), 才發報告, 另外最重要的是, 每次實驗都包含normal control,
homozygous mutation control, heterozygous mutation control 及blank control。發報告時間則嚴格控制在一至三個星期之內。